Manuel du SPIM au PIAF

2.1.1 Liste de composants

2.1.2 Filtres

2.1.3 Pièces spéciales

1. Chambre contenant d'observation
   

   La chambre du SPIM a été refaite par rapport au projet OpenSPIM pour être adaptée au système de cage Thorlabs. Elle est conçu pour fonctionner avec la pièces LCP30 et LCP02/M qui permettent de faire des angles droit sur le système de cage. Elle existe en deux version, la première avec des fenêtres pour coller des lamelles de microscope dessus afin de voir l'échantillon. La seconde sans les fenêtre, mais elle doit être imprimer avec un filament translucide.

   

   Vous pouvez éditer le fichier d'origine .fcstd pour modifier la chambre avec FreeCAD ou utiliser le fichier .stl pour imprimer la chambre.

   Version avec fenêtres:

   • Fichier FreeCAD: New chambre spim CF vitre cage system.fcstd
   • Fichier pour imprimante 3D: SPIM chambre cage system.stl

   Version sans fenêtres:

   • Fichier FreeCAD: New chambre spim CF sans vitre cage system.fcstd
   • Fichier pour imprimante 3D: SPIM chambre cage system pas fenetre.stl
2. Équerre de fixation du moteur 360 sur la platine XYZ
   

   Cette pièce permet de faire le lien entre la platine XYZ (en se fixant soit sur la platine, soit sur le goniomètre 2 axes) et le moteur de rotation. Les différentes parties la constituant on été dessinées en 3D sous FreeCAD et ensuite découpe à la découpeuse laser sur du plexi de 1cm d'épaisseur.

   

   Fichier:

   • Plan 3D FreeCAD: bras platine v2.fcstd

   Il faut sortir une esquisse 2D pour découpeuse (format .dxf) des différentes parties (soit 3 plans 2D, un pour la partie rouge, un pour la partie verte (a découper 2x) et un pour la partie orange de la figure 2).

3. Adaptateur qui permet de serrer les portes échantillons sur le moteur de rotation
   

   Les portes échantillons sont serrés à l'aide de cette pièce qui vient se fixer sur le moteur de rotation 360 et qui permet de serrer de cylindre de diamètre 7mm, le troue sur la tranche (diam 3.2mm) est ensuite taraudé pour venir loger un visse M4 qui vient fixer le porte échantillon.

   

   Fichiers:

   • Fichier 3d FreeCAD: rotation porte echt.fcstd
   • Fichier pour imprimante 3D: rotation porte echt.stl
4. Portes échantillons
   

   Deux types de portes échantillons ont été développé. Le premier permet de "coller" des blocs d'agar sur le support avec de l'agar chaud pour faire le collage.

   

   Fichiers:

   • Fichier 3d FreeCAD: porte echantillon agar.fcstd
   • Fichier pour imprimante 3D: porte echantillon agar.stl

   Le second permet de maintenir des tubes de FEP.

   TODO RECUP LES FICHIER DE FLORENT

5. Caches de protection laser
   

   Des caches en plastique "clipsable" sur les cages Thorlabs a été réalisé pour sécuriser le faisceau laser. Il y a plusieurs tailles pour adapter les caches aux différents portes objets mis sur les cages Thorlabs. La longueur du cache est a adapté pour chaque partie du SPIM directement dans le logiciel de préparation de l'impression 3D (pas besoin d'en refaire une dans FreeCAD)

   

   Taille (HxP)	fichier 3D FreeCAD	fichier imprimante 3D (dessus)	fichier imprimante 3D (dessous)
   36mm x 36mm	cache thorlabs cage 36x36.fcsdt	top 36x36.stl	bottom 36x36.stl
   43mm x 40mm	cache thorlabs cage 43x40.fcsdt	top 43x40.stl	bottom 43x40.stl
   43mm x 42mm	cache thorlabs cage 43x42.fcsdt	top 43x42.stl	bottom 43x42.stl

   Un cache spéciale est réalisé pour aller du système de cage au Laser.

   Fichiers:

   • Fichier 3D FreeCAD: cache thorlabs cage cobolt.fcstd
   • Fichier imprimante 3D: cache laser cobolt.stl

2.2.1 Montage de la caméra

1. Installation du support:
   

   Le support en plexi-glasse se fixe sous la caméra à l'aide de trois visses M6.

   

2. Branchement vers le PC:
   

   La caméra est connectée à l'ordinateur en "camera-link" ce qui nécessite de brancher deux câbles.

   Les deux prisent comporte des numéros, 1 et 2, il faut absolument respecter la correspondance entres les numéros sur la carte de l'ordinateur et sur la caméra! Sinon la caméra ne serra pas reconnue.

3. Mise en place de la lentille de tube:
   

   La lentille de tube installée actuellement sur le SPIM est une lentille de longueur focal 200mm. La longueur entre le capteur de la caméra et la lentille doit en théorie être proche de 200mm. Pour aider à l'ajustement de cette longueur une bague réglable a été ajouté en début de tube qui permet d'affiner la mise au point.

   Pour installe le tube il suffit de le visser sur la caméra après avoir enlever le petit cache en plastique.

   On peut aussi nettoyer la lentille de tube (qui se trouve à l'extrémité du tube opposée à la caméra).

4. Mise en place de la caméra sur le bras de détection du spim:
   

   Dévisser les deux petites visses des supports se trouvant sur le bras de détection avec la clef jaune (cf image). L'un sur le dessus l'autre sur un côté. Un fois ces visses desserrées, insérer le tube en faisant glisser la caméra le long de la table jusqu'à venir en butté de la bague de réglage du tube. Puis serrer uniquement la visse la plus proche de la caméra pour laisser libre le réglage de la netteté lors du réglage du SPIM.

5. Fixation de la caméra sur la table optique:
   

   Un fois la caméra en place fixer la avec deux vis M6 sur la table optique (cf image).

2.2.2 Montage de la platine

1. Fixation de la platine sur la platine manuelle xy
   

   La platine se fixe à l'aide de 3 visses M6, sur une plaque adaptatrice qui comporte 4 vis M6 fixées sur la platine manuelle de déplacement xy.

2. Fixation du goniomètre sur la platine
   

   Le goniomètre se fixe à l'aide de deux petites vis M4 (prendre les plus petites) et de deux rondelles épaisses sur la platine motorisée.

   Attention: pas de vis longues sur la platine, car ça peut l'endommager en l'empêchant de se déplacer correctement!

   

3. Fixation de l'équerre et du moteur de rotation
   

   L'équerre se fixe sur le goniomètre avec 4 vis M4 longues (en rouge sur la figure 11). Le moteur de ration se fixe au bout de l'équerre avec deux vis M6 et des écrous sous le moteur (en vert sur la figure 11). La distance de décalage entre le moteur et la platine motorisé peut être réglée en dévissant les deux vis M4 (en bleu sur la figure 11) au niveau de la gouttière et en faisant coulisser la partie verticale de l'équerre. Attention, il faut démonter l'équerre de la platine xyz motorisée avant de faire ce réglage car il faut forcer un peut pour faire coulisser les deux parties en plastique de l'équerre.

4. Branchement des moteurs
   

   Les 3 moteurs de la platine de rotation se branche sur le contrôleur (grosse boîte blanche) à l'aide de rallonges. Pour correspondre au fichier de configuration du logiciel micro-manager pour le spim, les moteurs doivent être branché dans l'ordre suivant:

   Axe	N° de prise sur
   des moteurs	contrôleur BSC203
   X	90875498
   Y	90875500
   Z	90875499

   Le moteur de rotation se branche sur un autre contrôleur (Kinesis, petit bloc rouge, une seule prise on peut pas se tromper).

2.2.3 Montage du laser

2.2.4 Montage de la roue de filtres motorisée

Pour installer la roue de filtres il suffit de brancher les tube du système de cage de part et d'autre de la sortie A de la roue. Deux visses ont été installées pour soutenir la partie moteur de la roue à filtres. La connexion se fait simplement avec un câble USB.

Pour charger les filtres, une façon de procéder et de basculer la sortie de la roue sur la sortie B et de dévisser les caches situés pour sortir (ou ajouter) les filtre en dévissant les bagues à l'aide de l'outil spécifique (petit cylindre rouge et gris). Si vous n'arrivez pas a sortir les filtres de cette façon, alors il faut démonter la caméra et la cage Thorlabs qui se trouve à gauche de la roue pour pouvoir l'ouvrir et changer les filtres plus facilement (voir le manuel papier de la roue dans le placard du SPIM).

3.4.1 Configuration du contrôleur de la platine XYZ

3.4.2 Configuration du contrôleur de rotation

3.4.3 Test avec APT USER

Quand la configuration des moteurs est faite (il faut la faire une seule fois après elle reste tant que l'ordinateur n'est remis à zéro), vous pouvez lancer APT User ou Kinesis pour tester les moteurs un à un à partir de chaque panneaux de contrôles qui viennent de s'ouvrir (voir capture d'écran Figure 14).

Appuyer sur le bouton Home/zero de chaque moteurs et voir si ils se déplacent.

Si vous ne voyez pas 4 contrôleurs, alors il faut refaire la configuration des moteurs dans APT Config. Si vous avez démarré Kinesis et que la configuration fait des choses étranges, il faut éteindre puis rallumer les contrôleurs.

3.6.1 Configuration des divers instruments

1. Configuration de la platine XYZ
   

   Pour controler les platines motorisées, MicroManager utilise APT, il n'y a pas encore de module pour Kinesis. Les infos sont sur la page: https://micro-manager.org/wiki/ThorlabsAPTStage

   Il faut penser a ajouter les fichier APT.dll, APT.lib, et APTAPI.h (pour platforme 64bit) à la racine du répertoire d'installation de MicroManager. Les version actuelles sur l'ordinateur de contrôle du SPIM sont disponibles ci-dessous:

   • APT.dll
   • APT.lib
   • APTAPI.h

   Suivre le guide d'installation graphique comme décrit sur la page web ThorlabsAPTSTage, pour les trois moteurs séparément.

   Il faut ensuite ajouter un couplage entre le moteur X et Y pour faire une platine XY. Pour ce faire on utilise le module Combo XY Stage qui se trouve dans la rubrique Utilities des nouveaux instruments.

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant la platine XYZ.

   • Partie # Devices

     # Devices
     Device,X,ThorlabsAPTStage,SCC001
     Device,Z,ThorlabsAPTStage,SCC001
     Device,Y,ThorlabsAPTStage,SCC001
     Device,Combo XY Stage,Utilities,Combo XY Stage
     

   • Partie # Pre-init settings for devices

     # Pre-init settings for devices
     Property,X,Channel,1
     Property,X,Position Lower Limit (um),0.0000
     Property,X,Position Upper Limit (um),4000.0000
     Property,X,Serial Number,90875498
     Property,Z,Channel,1
     Property,Z,Position Lower Limit (um),0.0000
     Property,Z,Position Upper Limit (um),4000.0000
     Property,Z,Serial Number,90875499
     Property,Y,Channel,1
     Property,Y,Position Lower Limit (um),0.0000
     Property,Y,Position Upper Limit (um),4000.0000
     Property,Y,Serial Number,90875500
     Property,Combo XY Stage,SimulatedXStepSizeUm,1.0000
     Property,Combo XY Stage,SimulatedYStepSizeUm,1.0000
     

   • Partie # Group: Platine (permet de definier les actions avant de commancer a utiliser le SPIM, soit: faire un "Home" de tous les moteurs et mettre les moteurs à mi-course)

     # Group: Platine
     ConfigGroup,Platine,Initialise,X,Go Home,1
     ConfigGroup,Platine,Initialise,Z,Go Home,1
     ConfigGroup,Platine,Initialise,Y,Go Home,1
     
     ConfigGroup,Platine,Initialise,X,Set position (microns),2000.0000
     ConfigGroup,Platine,Initialise,Z,Set position (microns),2000.0000
     ConfigGroup,Platine,Initialise,Y,Set position (microns),2000.0000
     

   • Partie #Combo XY settings (permet de regler le couplage XY)

     Property,Combo XY Stage,PhysicalStage-X,Y
     Property,Combo XY Stage,PhysicalStage-Y,Z
     Property,Combo XY Stage,TranslationUm-X,2000.0000
     Property,Combo XY Stage,TranslationUm-Y,2000.0000
     

2. Configuration d'arduino
   

   L'arduino se configure facilement en suivant la procédure décrite ici: https://micro-manager.org/wiki/Arduino

   Il vaut vérifier sur quel port "serie" a été reconnu la carte par Windows… Attention ce port peut changer! Pour le trouver:

   Gestionnaire de périphériques > Ports (COM et LPT) > trouver celui qui s'appel USB-SERIAL…

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant arduino:

   • Partie # Devices

     Device,COM9,SerialManager,COM9
     Device,Arduino-Hub,Arduino,Arduino-Hub
     Device,Arduino-Switch,Arduino,Arduino-Switch
     Device,Arduino-Shutter,Arduino,Arduino-Shutter 
     

   • Partie # Pre-init settings for arduino

     # Pre-init settings for arduino
     Property,Arduino-Hub,Logic,Normal
     Property,Arduino-Hub,Port,COM9
     Property,COM9,AnswerTimeout,500.0000
     Property,COM9,BaudRate,57600
     Property,COM9,DelayBetweenCharsMs,0.0000
     Property,COM9,Handshaking,Off
     Property,COM9,Parity,None
     Property,COM9,StopBits,1
     Property,COM9,Verbose,1
     

   • Partie # Hub (parent) references

     # Arduino
     Parent,Arduino-Switch,Arduino-Hub
     Parent,Arduino-Shutter,Arduino-Hub
     

   • Parie # Labels

     # Arduino-Switch
     Label,Arduino-Switch,63,63
     Label,Arduino-Switch,62,62
     Label,Arduino-Switch,61,61
     Label,Arduino-Switch,60,60
     Label,Arduino-Switch,59,59
     Label,Arduino-Switch,58,58
     Label,Arduino-Switch,57,57
     Label,Arduino-Switch,56,56
     Label,Arduino-Switch,55,55
     Label,Arduino-Switch,54,54
     Label,Arduino-Switch,53,53
     Label,Arduino-Switch,52,52
     Label,Arduino-Switch,51,51
     Label,Arduino-Switch,50,50
     Label,Arduino-Switch,49,49
     Label,Arduino-Switch,48,48
     Label,Arduino-Switch,47,47
     Label,Arduino-Switch,46,46
     Label,Arduino-Switch,45,45
     Label,Arduino-Switch,44,44
     Label,Arduino-Switch,43,43
     Label,Arduino-Switch,42,42
     Label,Arduino-Switch,41,41
     Label,Arduino-Switch,40,40
     Label,Arduino-Switch,39,39
     Label,Arduino-Switch,38,38
     Label,Arduino-Switch,37,37
     Label,Arduino-Switch,36,36
     Label,Arduino-Switch,35,35
     Label,Arduino-Switch,34,34
     Label,Arduino-Switch,33,33
     Label,Arduino-Switch,32,32
     Label,Arduino-Switch,31,31
     Label,Arduino-Switch,30,30
     Label,Arduino-Switch,29,29
     Label,Arduino-Switch,28,28
     Label,Arduino-Switch,27,27
     Label,Arduino-Switch,26,26
     Label,Arduino-Switch,25,25
     Label,Arduino-Switch,24,24
     Label,Arduino-Switch,23,23
     Label,Arduino-Switch,22,22
     Label,Arduino-Switch,21,21
     Label,Arduino-Switch,20,20
     Label,Arduino-Switch,19,19
     Label,Arduino-Switch,18,18
     Label,Arduino-Switch,17,17
     Label,Arduino-Switch,16,16
     Label,Arduino-Switch,15,15
     Label,Arduino-Switch,14,14
     Label,Arduino-Switch,13,13
     Label,Arduino-Switch,12,12
     Label,Arduino-Switch,11,11
     Label,Arduino-Switch,10,10
     Label,Arduino-Switch,9,9
     Label,Arduino-Switch,8,8
     Label,Arduino-Switch,7,7
     Label,Arduino-Switch,6,6
     Label,Arduino-Switch,5,5
     Label,Arduino-Switch,4,4
     Label,Arduino-Switch,3,3
     Label,Arduino-Switch,2,2
     Label,Arduino-Switch,1,1
     Label,Arduino-Switch,0,0
     
     
     # Preset bright light
     ConfigGroup,Channel,Bright,DWheel,Label,State-4
     ConfigGroup,Channel,Bright,Arduino-Switch,Label,2
     ConfigGroup,Channel,Bright,Core,Shutter,Arduino-Shutter
     

3. Configuration de la caméra
   

   L'interface entre MicroManager et la camera Hamamatsu se fait en utilisant le protocole DCAM-API de Hamamatsu. Une fois installé, il suffit d'utiliser le device hamamatsuHAM de MicroManager, voir les infos ici: https://micro-manager.org/wiki/HamamatsuHam

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant la caméra:

   • Partie # Devices

     Device,HamamatsuHam_DCAM,HamamatsuHam,HamamatsuHam_DCAM
     

   • Partie # Roles

     Property,Core,Camera,HamamatsuHam_DCAM
     

4. Configuration du laser
   

   Le laser utilise le device Cobolt de MicroManager voir la doc ici: https://micro-manager.org/wiki/Cobolt

   Le laser Cobolt est ici configuré sur le COM5 (voir le gestionnaire de périphériques dans la rubrique Ports (COM et LPT) et trouver la ligne qui commence par "Périphérique série USB".

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant le laser:

   • Dans # Devices

     Device,COM5,SerialManager,COM5
     Device,Cobolt,Cobolt,Cobolt
     Device,DShutter,DemoCamera,DShutter
     Device,Multi Shutter,Utilities,Multi Shutter
     

   • Dans # Pre-init settings for devices

     Property,Cobolt,Max Power,60.0000
     Property,Cobolt,Port,COM5
     

   • Dans # Pre-init settings for COM ports

     Property,COM5,AnswerTimeout,500.0000
     Property,COM5,BaudRate,115200
     Property,COM5,DelayBetweenCharsMs,0.0000
     Property,COM5,Handshaking,Off
     Property,COM5,Parity,None
     Property,COM5,StopBits,1
     Property,COM5,Verbose,1
     

   • Dans # Group: Laser

     ConfigGroup,Laser,2% (1mw),Cobolt,PowerSetpoint,1
     ConfigGroup,Laser,5% (3mw),Cobolt,PowerSetpoint,3
     ConfigGroup,Laser,10% (6mw),Cobolt,PowerSetpoint,6
     ConfigGroup,Laser,15% (9mw),Cobolt,PowerSetpoint,9
     ConfigGroup,Laser,20% (12mw),Cobolt,PowerSetpoint,12
     ConfigGroup,Laser,25% (15mw),Cobolt,PowerSetpoint,15
     ConfigGroup,Laser,30% (18mw),Cobolt,PowerSetpoint,18
     ConfigGroup,Laser,35% (21mw),Cobolt,PowerSetpoint,21
     ConfigGroup,Laser,40% (24mw),Cobolt,PowerSetpoint,24
     ConfigGroup,Laser,45% (27mw),Cobolt,PowerSetpoint,27
     ConfigGroup,Laser,50% (30mw),Cobolt,PowerSetpoint,30
     ConfigGroup,Laser,55% (33mw),Cobolt,PowerSetpoint,33
     ConfigGroup,Laser,60% (36mw),Cobolt,PowerSetpoint,36
     ConfigGroup,Laser,65% (39mw),Cobolt,PowerSetpoint,39
     ConfigGroup,Laser,70% (42mw),Cobolt,PowerSetpoint,42
     ConfigGroup,Laser,75% (45mw),Cobolt,PowerSetpoint,45
     ConfigGroup,Laser,80% (48mw),Cobolt,PowerSetpoint,48
     ConfigGroup,Laser,85% (51mw),Cobolt,PowerSetpoint,51
     ConfigGroup,Laser,90% (54mw),Cobolt,PowerSetpoint,54
     ConfigGroup,Laser,95% (57mw),Cobolt,PowerSetpoint,57
     ConfigGroup,Laser,100% (60mw),Cobolt,PowerSetpoint,60
     

   • Dans # Groups: Platine, Preset: Initialise (qui permet de couper le laser au démarage pour la sécu)

     ConfigGroup,Platine,Initialise,Cobolt,PowerSetpoint,1
     

   Le laser est temporisé à l'aide du "device" Multi Shutter, qui se trouve dans la rubrique utilities des "devices" et qui permet d'ajouter un délai de quelques secondes après l'allumage du laser afin de le laisser chauffer et se stabiliser.

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant le multi-shutter:

   • Dans # Devices

     Device,Multi Shutter,Utilities,Multi Shutter
     

   • Dans # Roles

     Property,Core,Shutter,Multi Shutter
     Property,Core,AutoShutter,0
     

   • Dans # Group: Channel

     # Preset GRP
     ConfigGroup,Channel,GFP,Core,Shutter,Multi Shutter
     
     # Preset bright light
     ConfigGroup,Channel,Bright,Core,Shutter,Arduino-Shutter
     

   • Dans # Multi-shutter config

     # Multi-shutter config
     Property,Multi Shutter,Physical Shutter 1,DShutter
     Property,Multi Shutter,Physical Shutter 2,Cobolt
     

5. Configuration du moteur de rotation 360
   

   Le moteur de rotation 360 utilise le même "device" que les moteurs de la platine XYZ pour être contrôle avec MicroManager soit ThorlabsAPTStage dont la documentation est dispo ici: https://micro-manager.org/wiki/ThorlabsAPTStage

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant le moteur de rotation:

   • Partie # Devices

     Device,Rotation,ThorlabsAPTStage,TDC001
     

   • Partie # Pre-init settings for devices

     Property,Rotation,Channel,1
     Property,Rotation,Position Lower Limit (um),0.0000
     Property,Rotation,Position Upper Limit (um),360000.0000
     Property,Rotation,Serial Number,27503845
     

   • Partie # Group: Platine, Preset: Initialise…

     ConfigGroup,Platine,Initialise,Rotation,Go Home,1
     

6. Configuration de la roue à filtres motorisée
   

   La configuration de la roue à filtre motorisée utilise le "device" ThorlabsFilterWheel. La roue est branchée sur le COM10 et a un vitesse de connexion de 115 200 (voir le manuel papier dans le tiroir du SPIM pour les infos de connexion)

   Ci-dessous les parties du fichier de configuration spim_version1_arduino.cfg concernant la roue à filtres:

   • Partie #Devices

     Device,COM10,SerialManager,COM10
     Device,Thorlabs Filter Wheel,ThorlabsFilterWheel,Thorlabs Filter Wheel 
     

   • Partie # Pre-init settings for devices

     # Pre-init settings for COM port of Thorlabs Filter Wheel 
     Property,COM10,AnswerTimeout,500.0000
     Property,COM10,BaudRate,115200
     Property,COM10,DelayBetweenCharsMs,0.0000
     Property,COM10,Handshaking,Off
     Property,COM10,Parity,None
     Property,COM10,StopBits,1
     Property,COM10,Verbose,1
     Property,Thorlabs Filter Wheel,Port,COM10
     

   • Partie Labels

     Label,Thorlabs Filter Wheel,5,Filter-6
     Label,Thorlabs Filter Wheel,4,Filter-5
     Label,Thorlabs Filter Wheel,3,Filter-4
     Label,Thorlabs Filter Wheel,2,GFP 525/39
     Label,Thorlabs Filter Wheel,1,FEL500 (passe sup 500)
     Label,Thorlabs Filter Wheel,0,ND FILTER
     

   • Partie Configuration presets

     # Group: Filtres
     # Preset: Position 1
     ConfigGroup,Filtres,Filtre-ND-NG20,Thorlabs Filter Wheel,State,0
     # Preset: position 2
     ConfigGroup,Filtres,Filtre-LongPass500,Thorlabs Filter Wheel,State,1
     # Preset: position 3
     ConfigGroup,Filtres,Filtre-GFP-525pm39,Thorlabs Filter Wheel,State,2
     # Preset: Position 4
     ConfigGroup,Filtres,Vide-pos4,Thorlabs Filter Wheel,State,3
     # Preset: Position 5
     ConfigGroup,Filtres,Vide-pos5,Thorlabs Filter Wheel,State,4
     # Preset: Position 6
     ConfigGroup,Filtres,Vide-pos6,Thorlabs Filter Wheel,State,5
     
     # Group: Channel
     # Preset GFP (multishutter on)
     ConfigGroup,Channel,GFP,Thorlabs Filter Wheel,State,2
     ConfigGroup,Channel,GFP,Core,Shutter,Multi Shutter
     
     # Preset bright light
     ConfigGroup,Channel,Bright,Arduino-Switch,Label,2
     ConfigGroup,Channel,Bright,Core,Shutter,Arduino-Shutter
     ConfigGroup,Channel,Bright,Thorlabs Filter Wheel,State,3
     

3.6.2 Configuration de l'interface de micro-manager

L'interface de MicroManager en v2 peut être personnalisée avec des lanceurs rapides "Quick Access Panel". Celui du SPIM (voir Figure 15) est enregistré dans le fichier Quick_Pannel_SPIM qui se trouve dans le même dossier que le fichier de configuration de MicroManager. Il se charge dans le menu Tools > Quick Access Panels > Load Settings…

3.6.3 Script de suivi d'une racine avec la platine

C:\Users\mecaspim\Documents\spim_micromanager_scripts

//SCRIPT POUR FAIRE UN TRACKING TRES SIMPLE d'UNE RACINE
//Regarde si on a un signal fluo a une position donnée 
//sur l'image puis décale cetteposition au centre de FOV
//Pour le SPIM

// H. Chauvet
// Version: 27062019
mm.scripter().resetInterpreter();
import org.jfree.chart.JFreeChart;
import org.jfree.chart.ChartFactory;
import org.jfree.chart.ChartFrame;
import org.jfree.data.xy.XYSeries;
import org.jfree.data.xy.XYSeriesCollection;
import org.jfree.chart.plot.PlotOrientation;
import org.micromanager.data.Coords;
import java.lang.Math;



//Fonction pour récupérer la moyenne des pixels à un Y donnée sur l'ensemble du zstack pour un temps donnée
float[] getLineMaxProj(int time, int chan, int plane, int Y_POS) {
    /*
     * time, le temps sur lequel on veut faire la moyenne
     * chan, le channel
     * plane, la tuile en xy que l'on veut utiliser
     * Y_POS, la position en y sur l'image ou l'on veut faire la moyenne
     * 
     */

    //Recup de la fenetre ouverte
    dw = mm.displays().getCurrentWindow();

    //Recup le datastore de la fenetre
    data=dw.getDatastore();
    //On chope les limites 
    indices=data.getMaxIndices();
    maxZ=indices.z;

    W = mmc.getImageWidth();

    // Vecteur pour stoquer les max pour chaque pixel de la ligne
    float[] maxpix = new float[W];

    //On cherche le max sur l'ensemble du stack en z
    for (int z=0; z<=maxZ; z++){
        coords=mm.data().createCoords("t="+time+",p="+plane+",c="+chan+",z="+z);
        //print(coords);
        if (data.hasImage(coords)){
            //print("process pixels");
            imgT=data.getImage(coords);
            ij_processor=mm.data().ij().createProcessor(imgT);
            //print(ij_processor.getRoi());
            //print(ij_processor.getStatistics());
            //print(pixdata);
            for(int i=0; i<W; i++){
                pixdata = ij_processor.get(i, Y_POS);
                //print(i);             
                if (maxpix[i] < pixdata){
                    maxpix[i] = pixdata;
                }
            }

        } else {
            print("No image found for:");
            print(coords);      
        }
    }

    //print(maxpix);
    return maxpix;
}

//Fonction pour avoir le max
float max(float[] numlist){
    float tmpmax = numlist[0];
    for (num: numlist){
        if (num > tmpmax){
            tmpmax = num;
        }
    }

    return tmpmax;
}

//Fonction pour avoir le min
float min(float[] numlist){
    float tmpmin = numlist[0];
    for (num: numlist){
        if (num < tmpmin){
            tmpmin = num;
        }
    }

    return tmpmin;
}

//Fonction pour calculer la moyenne
double mean(float[] numlist){
    double sum = 0;
    double n = 0;
    for (i: numlist){
        sum += i;
        n += 1;
    }

    return sum/n;
}

//Fonction pour calculer le std
double std(float[] numlist){
    m = mean(numlist);
    double sum=0;
    double n = 0;
    for (i: numlist){
        sum += Math.pow((i-m), 2.0);
        n+=1.0;
    }
    return Math.pow(sum/n, 0.5);
}



class SimpleRacineTrackRunnable extends Thread {
    //initialisation des variables
    protected volatile boolean check_acquisition = true;
    int dtsleep = 100;

    acq = mm.acquisitions();

    H = mmc.getImageHeight();
    W = mmc.getImageWidth();

    //Il faut regler ça en fonction de la vitesse de croissance d'une racine
    //En gros 0.01 - 0.02 µm/s soit ~1µm/min -> pour un dt toute les 30min: 36µm
    //Ecart entre 4/6 et 5/6 de l'image c'est ~89µm
    int Y_MEASURE = (int) Math.round(H * (5/6.0)); 
    int Y_REF = (int) Math.round(H * (4/6.0));
    //La platine
    xyStage = mmc.getXYStageDevice();

    int cpt = 1;
    double ref_std = 0;
    float std_offset = (float) 1.5; //Le seuill de déclanchement pour dire qu'il y a une racine 2*std semble bien

    //correspondance pixel um (pour la platine)
    pxtoum = mmc.getPixelSizeUm();
    //On recupere l'engine de l'acquistition
    acq_engine=acq.getAcquisitionEngine();

    //Initialisation des series pour tracer les données
    XYSeries linedata = new XYSeries("RacinePixels");
    XYSeriesCollection dataset = new XYSeriesCollection();
    dataset.addSeries(linedata);

    public SimpleRacineTrackRunnable() {
        // Mon constructeur
    }

    public void run() {         
        init_plot();
        while(check_acquisition){
            if (acq.isAcquisitionRunning()){
                //print("Acquisition is running");
                data_acq = acq_engine.getAcquisitionDatastore();

                //On choppe les métadonnées
                metad = acq_engine.getSummaryMetadata(); 
                //max_frame = metad.getInt("Frames"); //nombre de temps
                max_slice = metad.getInt("Slices"); //max de z

                //Store current indices 
                //cur_pos = indices.position;
                try{
                    cur_total = data_acq.getNumImages();

                    //borne inf
                    binf = cpt*max_slice;
                    bsup = (cpt+1)*max_slice;

                    if (cur_total >= binf  && cur_total < bsup){
                        print("Fin du stack pour la frame " + (cpt-1) + " Lancer la détection de la racine");
                        //On fait une pause dans l'acquisition
                        //data_acq.setPause(true);
                        //On fait la mesure
                        maxlinepixels = getLineMaxProj((cpt-1), 0, 0, Y_MEASURE);
                        //Store data in XYserie for ploy
                        linedata.clear();
                        for (int it=0; it<maxlinepixels.length; it++){
                            linedata.add(it, maxlinepixels[it]);
                        }

                        //SI c'est le premier stack, on definit le niveau de fond de l'image
                        if (cpt == 1){
                            ref_std = std(maxlinepixels);
                            //Pour faire un test 
                            //ref_std = 0.1;
                            print("Std de référence du fond " + ref_std);
                        } else{
                            //On fait une nouvelle mesure et on regarde si elle depasse le seuil
                            tmpstd = std(maxlinepixels);
                            ratio = tmpstd/ref_std;
                            print("Std mesuré " + tmpstd + " diff référence " + ratio );

                            if (ratio > std_offset){
                                print("La racine touche la ligne, je recentre la platine");
                                //On bouge la platine
                                deltapix = Y_MEASURE - Y_REF;
                                deltaum = pxtoum * deltapix;

                                //Sur notre platine il faut descendre pour faire remonter l'image!
                                curpos = mmc.getYPosition();
                                curxpos = mmc.getXPosition();
                                print("Nouvelle position" + (curpos+deltaum));
                                if ((curpos+deltaum) < 2000 ){
                                    print("Deplace la platine verticalement de " + deltaum +" µm");
                                    mmc.setXYPosition(xyStage, curxpos, curpos+deltaum);
                                }

                            }
                        }

                        //update frame counter
                        ++cpt;

                        //data_acq.setPause(false);
                    }
                } catch (e) {
                    print("Erreur, probablement pas encore d'images");
                    print(e); 
                }
            }

            Thread.sleep(dtsleep);
        }
        print("Stop the tracker -> OK");
    };

    public void stop_tracker() {
        check_acquisition = false;
        cpt = 1;
        std_ref = 0;
        linedata.clear();
    };

    public void init_plot() {
        JFreeChart chart = ChartFactory.createXYLineChart("Profil ligne autodetection racine", // Title
                                                          "x", // x-axis Label
                                                          "Gray value", // y-axis Label
                                                          dataset, // Dataset
                                                          PlotOrientation.VERTICAL, // Plot Orientation
                                                          false, // Show Legend
                                                          false, // Use tooltips
                                                          false // Configure chart to generate URLs?
                                                          );

        ChartFrame graphFrame = new ChartFrame("Test", chart);
        graphFrame.getChartPanel().setMouseWheelEnabled(true);
        graphFrame.pack();
        graphFrame.setVisible(true);    
    };

};

Thread racine_tracker = new SimpleRacineTrackRunnable();
racine_tracker.start(); 

void stop_tracker(Runnable tracker_runnable){
    /*
     * Fonction pour arreter un tread qui a une boucle infinie
     */
    tracker_runnable.stop_tracker();
    tracker_runnable.join(1000);
}

try{
    //Pour arreter le tracker il suffit d'utiliser cette fonction
    stop_tracker(racine_tracker);
} catch(e){
    print("Erreur pour stopper le tracker de racine");
    print(e);
}

3.6.4 Script pour mettre en place une photopériode

// Configuration d'arduino pour l'illumination avec la lumière blanche
// cf: https://micro-manager.org/wiki/Arduino

// PARAMETRES
switch_pin="2"; // pin 9 2**1 en bit
day_period=16.; // periode en heure 
first_period_delay=4.0; //delay en heure avant le premier changement (pour synchro avec la chambre de culture)
init_as_day=true; //doit on démarer en jour ou nuit

switch_name = "Arduino-Switch";
shutter_name = "Arduino-Shutter";
onoff_name = "OnOff";
cobolt_name = "Cobolt";

// Get the acquisition engine
acq = mm.getAcquisitionEngine();

LIGHT_RUN = true;
PERIOD=0;
JOUR_STATE=true;

// Convert time to milliseconds
day_period *= 3600.0 * 1000.0;
first_period_delay *= 3600.0*1000.0;

// Do we need to take into account a delay of the first switch between day and night
if(first_period_delay > 0){
    PERIOD = first_period_delay;
} else {
    PERIOD = day_period;
}

if (init_as_day == false){
    JOUR_STATE = false;
}
//INIT CURTIME
CURTIME=System.currentTimeMillis();

while(LIGHT_RUN){
    if (System.currentTimeMillis()-CURTIME >= PERIOD){
        CURTIME = System.currentTimeMillis();

        // Change the state between day and night
        if (JOUR_STATE){
            JOUR_STATE = false;
        } else {
            JOUR_STATE = true;
        }

        // If a delay as been set at starting time, change the period to the day_period
        if (PERIOD != day_period){
            print("end of initialisation switch to day_period");
            PERIOD = day_period;
        }

    }

    cur_shutter_state = mmc.getProperty(shutter_name, onoff_name);



    if (mmc.getProperty("Multi Shutter", "State").equals("0")){
        // Change the arduino pin to the light one 
        mmc.setProperty(switch_name, "Label", switch_pin);

        // Do I need to light up
        if (JOUR_STATE){
            if (cur_shutter_state.equals("0")){
                mmc.setProperty(shutter_name, onoff_name, "1");
            }
        }

        // Do I need to light down
        else{
            if (cur_shutter_state.equals("1")){
                mmc.setProperty(shutter_name, onoff_name, "0");
            }
        }       
    } else {
        //Need to shutdown the light when acquisition is running
        if (cur_shutter_state.equals("1")){
            mmc.setProperty(shutter_name, onoff_name, "0");
        }
    }

    Thread.sleep(100);
}
}

3.6.5 ImageJ et les plugins utiles pour le SPIM

4.4.1 Réglage puissance laser

4.4.2 Réglage de la lumière blanche

6.1.1 Alignement complet du SPIM

1. Démontage du premier segment du bras d'illumination
   

   Sur le premier segment du bras d'illumination du SPIM il y a (de droite à gauche):

   • un télescope qui permet de grossir le faisceau du laser (d'un facteur 2, Il se compose de deux lentilles une avec une focal de 25mm et une autre avec une focal de 50mm),
   • une fente (qui permet de limiter les aberrations du faisceau sur les côtés),
   • et une lentille cylindrique qui permet d'aplanir le faisceau laser.

   Pour démonter le télescope, il faut deux outils: Les clefs Allen jaune et marron et le petit démonte lentille (tube argenté creux avec deux petits picots).

   Ensuite placer les boîtes des lentilles ouverte sous le bras pour amortir les chutes éventuelles et utiliser des gants pour ne pas laisser de trace de doigts sur les lentilles.

   Enlever la première lentille (f=25) en dévissant la vis du dessus avec la clef jaune, puis en poussant avec le doigt de droite à gauche pour faire sortir la lentille. Ranger la lentille dans sa boîte.

   Enlever la deuxième lentille (f=50) en dévissant la bague à gauche du porte lentille avec le démonte lentille, puis faire sortir la lentille de gauche à droite. Ranger la lentille dans sa boîte.

   Ouvrir la fente au maximum, en tournant la vis micro-métrique située sur le dessus.

   Enlever la lentille cylindrique en utilisant un petit tourne vis plat pour commencer à desserrer la bague du côté gauche, puis utiliser la main pour finir de la desserrer (attention de ne pas rayer la lentille avec le tournevis au début). Il faudra desserrer le porte lentille avec une petite clef Allen marron pour le faire coulisser sur la droite pour desserrer plus facilement la bague. Retirer la lentille cylindrique en la poussant de droite à gauche (en utilisant une clef Allen délicatement)

2. Démontage du deuxième segment du bras d'illumination
   

   Sur le second segment du bras d'illumination on trouve uniquement un second télescope qui permet de réduire la taille du faisceau d'un facteur 2 (il est composé d'un lentille de focal 50mm et d'une autre de focal 25mm).

   Pour pouvoir extraire les lentilles vous devrez peut être déplacer les porte lentille, en desserrant les 4 petites visse avec la clef marron ou jaune pour faire les faire coulisser sur le rail.

   Démonter la première lentille (f=50mm) avec en enlevant la bague située à gauche à l'aide du démonte lentille. Enlever la lentille.

   Démonter la seconde lentille (f=25mm) en desserrant la vis située sur le dessus avec la clef jaune. Enlever la lentille.

3. Alignement du laser
   

   1. Avant de régler le laser penser soit à mettre sa puissance à 1mw. Soit porter les lunettes de protection.
   2. Enlever les objets réfléchissant de vos mains (pas de bagues, pas de pendentifs, etc…)

   L'alignement d'un laser est un processus itératif assez lent, donc il faut s'armer d'un peu de patience le jour où vous prévoyez de le faire. Il faut compter une bonne journée de travail pour procéder à l'alignement complet du SPIM.

   Pour aligner un laser (c.a.d lui donner un trajet rectiligne au milieu des barres métalliques), il faut utiliser deux miroir et avec une cible d'alignement (figure 24). Il faut suivre toujours la procédure suivante:

   1. Mettre la cible proche du miroir 2 et utiliser le miroir 1 pour régler la position du laser au centre de la cible (il doit passer dans le petit trou).
   2. Éloigner la cible vers le miroir 3 et utiliser le miroir 2 pour régler la position du laser au centre de la cible. En bougeant le miroir 2 on change la position du laser de l'étape 1 et c'est normal !
   3. On répète les étapes 1 et 2 dans l'ordre jusqu'à obtenir un faisceau laser qui passent par le centre de la cible sur toute la longueur du premier segment.

   Une fois le premier segment aligné, il faut aligner le second. Pour ce faire on utilise uniquement le miroir 3 avec cette fois-ci les 3 vis (la dernière nécessite l'utilisation d'une clef Allen):

   1. Mettre la cible la plus loin possible du miroir 3 et utiliser les deux vis pour centrer le laser.
   2. Rapprocher la cible du miroir 3 et utiliser la 3ème vis (celle nécessitant la clef Allen) pour recentrer le laser. En bougeant cette vis le laser vas se déplacer de biais (à la fois horizontalement et verticalement).
   3. Répéter ces 2 opération jusqu'à obtenir un laser centrer sur toute la longueur du deuxième segment.

   Pour "pofiner" l'alignement (et faire une auto-collimation, en pratique pas très utile car ensuite on va re-bouger un peu le laser pour l'aligner en face de la caméra), on peut utiliser un miroir supplémentaire (monté sur un clip qui se fixe sur les rails métalliques) que l'on vient ajouter au bout du premier segment. On place ensuite une cible proche du miroir 2 et on regarde si le laser repasse par le trou de la cible. (quand il parfaitement aligné, le laser brille plus). On peut répéter cette opération sur le deuxième segment en plaçant le miroir le plus loin possible.

   Pour finir l'alignement on va mettre en marche la camera du SPIM visualiser le laser:

   1. Pour ça on démarre Micro-Manager (on pense a allumer les contrôleurs des platines, la caméra et la roue à filtres sinon la configuration de Micro-Manager ne va pas s'ouvrir et à remplir la cuve avec de l'eau filtrée)
   2. On monte un peu la puissance du laser (vers 4-5mw, 5%)
   3. On vérifie qu'il n'y a pas de filtre sur le bras de detection
   4. On démarre le live pour visualiser le laser (régler correctement le temps d'acquisition et les contraste sur l'histogramme)
   5. On peut ajouter une mire ou une grille sur l'image pour s'aider à positionner le laser au centre. Sur la fenêtre de l'histogramme (Inspector Windows) -> overlays -> Add

   A ce stade de l'alignement le laser doit être rectiligne et au centre de l'image (figure 25). Si le laser semble un peu flou, il faut ajuster la bague réglable sur le bras de détection (proche de la caméra, Figure 8)

   

   Si le laser n'arrive pas au centre il faut régler la chambre:

   1. Soit le n'est pas trop loin du centre, on peut alors jouer avec l'inclinaison de la chambre en dévissant la vis se trouvant sur le pied de devant.
   2. Soit il est très loin du centre, il faut alors retravailler la position de l'objectif de détection par rapport à celui de l'illumination. Pour cela il faut utiliser les deux petites molette de la bague de réglage XY qui permettent de jouer légèrement sur la position de l'objectif de détection (située entre la roue à filtres et l'objectif). Ces molettes sont bloquées à l'aide de deux petites visses, il faut la petit clef bleue pour les desserrer (penser à les resserrer quand le réglage est bon). Vous pouvez aidez le déplacement de l'objectif en appuyant doucement dessus au niveau de cette bague de réglage XY. Si cela ne suffi pas, alors il faut démonter l'axe de détection et re-ajuste l'alignement de objectif de détection à la main.

   Avant d'aller plus loin et de remonter les lentilles il faut que le laser soit bien au centre de la chambre et rectiligne !

4. Re-montage des deux télescopes
   

   Éteindre le laser avant de remettre les lentilles

   Commencer par le télescope du premier segment (celui le plus proche du laser). Remettre les deux lentilles (f=25 le plus à droite et f=50, voir le schéma de la figure 23).

   La distance entre les deux lentilles doit être approximativement de 75 mm (f50+f25). Le réglage fin se fait en regardant le faisceau sur la caméra.

   Commencer par corriger l'alignement du laser (le remettre au centre de l'image) avec les deux vis du miroir 3.

   Puis régler finement la distance entre les deux lentilles de tels sorte que le faisceau soit le plus nette possible sur la caméra et qu'il soit le plus fin au centre (Figure 26).

   

   Faire de même pour le second télescope sur le second segment du bras d'illumination. Attention les lentilles sont dans l'autre sens f=50 puis f=25. Le faisceau obtenu à l'écran s'écrase un peu moins au centre, mais il faut faire les réglage avec les deux vis du miroir 3 pour qu'il soit centrée et symétrique par rapport au centre. Il faut également régler l'espacement entre ces deux lentilles pour que le faisceau soit le plus nette possible.

5. Re-montage de la lentille cylindrique
   

   Remettre en place la lentille cylindrique, un signe gravé le bord de la lentille (\(\rightarrow \infty\)) permet de la mettre dans le bon sens. La lumière du premier télescope sort avec des rayons parallèle, il faut donc mettre la lentille de telle sorte que la flèche \(\rightarrow \infty\) pointe vers la droite (vers la source laser).

   Serrer la lentille avec une petite bague en métal (il faut la visser à la main avec un gant car l'outil pour serrer les bagues ne passe pas dans la cage. Finir avec un tourne vis plat en visant la petite encoche dans la bague, ne pas trop serrer et faire attention à ne pas rayer la lentille.

   Mettre le laser à 1mw et Placer la lentille pour que l'image d'un ligne lumineuse soit nette sur le miroir 3 (il faut pencher la tête pour la voir). La distance entre le porte lentille (pièce qui se fixe sur les rails métalliques) et le bord du porte miroir 3 est d'environs 55.1mm (longueur du rail entre le miroir et le porte lentille).

   Fixer le porte lentille sur les rails avec la clef Allen orange.

   Le support de la lentille cylindrique peut tourner à 360° horizontalement. Pour aligner verticalement la feuille de lumière dans la chambre, on peut faire un premier réglage grossier en regardant la fente (situé à droite de la lentille) ou normalement deux lignes forment un croix (une petite ligne et une ligne plus épaisse). Si vous ne les voyiez pas bien, il faut augmenter un peu la puissance du laser. Il faut tourner la lentille cylindrique pour que la ligne de lumière la plus fine soit horizontale (ce qui la rend verticale dans la chambre d'observation). Le réglage fin de l'orientation est réalisé dans le paragraphe suivant (Voir 6.1.2).

   À la caméra, vous devriez vous des bulles et poussières présentent dans l'eau réfléchir la lumière sur toute la surface de l'image. Vous pouvez aussi regarder sur le côté gauche de la chambre vous devriez vous une feuille de lumière.

6.1.2 Vérification de l'alignement de la feuille de lumière

Pour aligner précisément la feuille de lumière, on va l'intercepter avec un objet plan que l'on visualiser à 45° par rapport à l'objectif de détection. On peut soit utiliser un miroir, soit une un quadrillage très fin sur feuille d'or (on en a eu un plaque gratos du synchrotron).

J'ai coupé un petit morceau de cette feuille que j'ai entouré de sotch transparent. Je fixe ensuite se petit morceau sur un porte échantillon avec de la "patte à fix" (cf figure 27-a). Puis je place le porte échantillon à 45 deg (cf figure 27-b) et j'observe la grille avec la lumière blanche. Je viens me placer dans le plan focal, on ne voit alors qu'une ligne de la grille verticale de la grille (cf figure 27-c). Cette ligne peut être un peu de biais et pas parfaitement verticale, ce n'est pas important.

Ensuite on allume le laser, on le met le plus bas possible (si c'est encore trop fort —sature la caméra— on met en place le filtre de densité neutre "ND filter" pour diminuer la puissance envoyer vers la caméra). On ajuste ensuite la position de la feuille de lumière en utilisant les deux vis du miroir 3 et surtout celle qui permet de déplacer la feuille de lumière en profondeur (la vis en bas à gauche). On vient mettre la feuille de lumière pour la faire coïncider avec la zone nette que l'on avait en lumière blanche. On ajuste également l'angle de la feuille de lumière (en tournant la lentille cylindrique) pour qu'elle soit dans le plan focal (plan nette) sur toute la hauteur du champ de vue (cf figure 27-d).

On peut ensuite faire varier la position latérale du porte échantillon pour voir si la feuille de lumière suit bien la zone nette sur toute la largeur du champ de vue (cf animation de la figure 28). Quand le réglage est bon, on fige la rotation de la lentille à l'aide d'une clef Allen.

On peut faire la même opération en plaçant au bout du porte échantillon un petit morceau de miroir (il y en a un dans la même boîte que la feuille d'or), et en faisant la mise au point sur une zone ou il y a des défauts sur le miroir.

Une fois la feuille bien au centre du plan focal, c'est tout bon. On peut poursuivre soit en passant un échantillon, soit en passant des billes de tailles connues pour vérifier notre alignement et estimer la PSF de l'instrument.